MANUAL DE MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO DAS PARASITOSES INTESTINAIS E ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA

Contamos com esse material em nosso trabalho, para que as pessoas possam ter uma idéia dos métodos usados pelos médicos, ao diagnosticarem um paciente. (estes métodos de parasitoses são usados em pacientes com teníase)

INTRODUÇÃO:

Como acontece nas maiorias das doenças, nas parasitoses um diagnóstico clinico definitivo é raramente uma condição com margem satisfatória de segurança, pois normalmente existem várias patologias determinantes de sintomatologia semelhante, ocorrendo ainda em muitos casos  infecção concomitante por mais de uma espécie de parasitas (pluriparasitismo). Portanto, a confirmação á nível laboratorial é uma condição importantíssima para orientação terapêutica precisa, avaliação de prognóstico e estudos epidemiologicos. Porém, para que sejam obtidos  melhores resultados diagnósticos, é importante a escolha do(s) método(s) de maior sensibilidade para detecção da etiologia da lesão, se confirmando assim a(s) hipótese(s) diagnostica(s) correta(s). Para tal fim, é indispensável que se tenha noções não só dos procedimentos técnicos nos diversos métodos diagnósticos que podem ser utilizados em cada caso, como  também,  de seus fundamentos, correta coleta de material para exame e suas possíveis  causas de erros em decorrência das diferenças relativas às diferentes  formas parasitárias, para parâmetros como a densidade da forma parasitária, tropismos e localização na amostra fecal ou no hospedeiro.

                 Além das técnicas tradicionais para copropesquisa parasitária, pode-se contar com outras, tais como  o “enterotest”, pesquisa de antígenos parasitários em fezes através de anticorpos  monoclonais e a pesquisa de ADN do parasita que se suspeita ser a causa de agressão, neste caso utilizando-se principalmente a reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR). Apesar da sedução tecnológica e da inegável margem de segurança destas técnicas é importante que seja avaliada a realidade econômica de nosso país e as limitações de estocagem de reagentes utilizados em tais provas. Portanto, será dado ênfase neste manual aos métodos de maior exequibilidade e baixo custo, mas que apresentam significativa sensibilidade diagnóstica para as enteroparasitoses ou de outras localizações, mas que apresentem em seu ciclo elimitação de estruturas parasitárias pelas fezes como é o caso da esquistossomose mansônica e fasciolose hepática.

I. BOAS PRÁTICAS EM COPROPARASITOLOGIA

            Em razão Das fezes serem um potencial veículo para vários agentes infecciosos e a manipulação de vidrarias e afins poder determinar acidentes com lesões nos operadores destes materiais,  devem ser observados diversos cuidados gerais, não só no planejamento e execução das instalações, bem como na rotina de trabalho dos integrantes destes laboratórios.

I.1 SINÓPSE DE BIOSSEGURANÇA EM COPROPARASITOLOGIA

A.  NORMAS GERAIS:

• Planejar/adequar as instalações físicas, para redução de riscos operacionais;
• Colocar manual de biossegurança e caixa de primeiros socorros, em local acessível e de conhecimento geral;
• Treinar todos os integrantes do laboratório, nas normas contidas no manual e respectiva fiscalização para sua aplicação;
  • Nomear responsável por turno de trabalho como responsável pela fiscalização e primeiros socorros;
  • Ao manipular o material fecal, trabalhar exclusivamente em bancada própria, não se aceitando improvisações exceto em condições de campo;
  • Lavar sempre as mão antes e após o termino parcial ou total das atividades;
  • Cortar regularmente as unhas, mantendo-as curtas;
  • Sempre utilizar luvas de manipulação, com sua região distal cobrindo a ponta do jaleco;
  • Impedir  a entrada de pessoas estranhas na área operacional do laboratório;
  • Proibir comer, beber, fumar e aplicar cosméticos no interior da área de trabalho;
  • Limpar antes, após o trabalho individual e toda vez que se tenha ocorrido contaminação local,  o piso, bancadas de trabalho e outras partes que possam sofrer contaminação,  com substâncias desinfetantes tais como hipoclorito de sódio a 1 %,  etanol a 70 %, etanol iodado a 70 % ou solução de formaldeido a 3 %.

B. MANUSEIO DE AMOSTRAS CLÍNICAS:

• Nunca utilizar vidrarias danificadas (rachadas, lascadas ou estilhaçadas);
• Cubrir qualquer lesão com curativos que impeçam contado desta superfície corporal com possíveis materiais que contenham agentes contaminantes;
• Utilizar jaleco de manga longa, evitando área   cutânea do braço descoberta;
• Empregar  pipetas automáticas ou peras de aspiração, nunca pipetar com a boca;
• Em caso de contaminação da pele com sangue, por corte ou contato superficial, logo após o acidente lave a área várias vezes com água e sabão neutro;
• Caso ocorra contato de sangue com o globo ocular, lave várias vezes com grandes quantidades de água;
• Sempre que ocorrer contaminação com fezes em superfícies do laboratório, deve ser colocada no local solução  hipoclorito de sódio a 1 % através de bomba de esguicho e após alguns minutos, limpar a área com gaze embebida na mesma solução, repetindo-se a operação se necessário;
• Incinerar ou colocar em solução descontaminante as amostras clínicas e resíduos fecais de exame;
• Se possível , implantar sistema de esgoto específico para laboratórios que manipulam fezes;
• Introduzir  cuidadosamente em recipientes, um  para cada tipo de material,  contendo solução de hipoclorito de sódio a 1 %, ou formaldeido a 5 %, lâminas de microscopia, pipetas descartáveis  e vidrarias  contendo as amostras clínicas.

II. PESQUISA COPROPARASITOLÓGICA

A.  COLETA DO MATERIAL FECAL

                Para obtenção de melhores resultados, devem ser sempre que possível utilizadas fezes recentemente emitidas ou preservadas por conservadores apropriados, isentas de contaminantes tais como urina, terra, enemas e outros. O fornecedor da amostra fecal, deve ser instruído coletar o material ou diretamente no recipiente, ou no caso de impossibilidade, para utilizar plástico ou papel, isento de impurezas para tal coleta e posterior transferencia da amostra fecal par o mesmo, com o auxílio de espátulas.

A.1  ACONDICIONAMENTO

                Dependendo da disponibilidade de material, objetivos e outras peculiaridades da pesquisa tais como distância e transporte, poderemos utilizar vários tipos de acondicionantes que variam desde embalagens plásticas de filmes fotográficos, frascos plásticos vendidos para tal fim, potes de boca larga como os de comida industrializada de crianças até sacos plásticos (P.e. trabalhos de campo), os últimos de enorme utilidade em pesquisa quando o número de amostras coletadas for grande, pois eliminam o espaço morto entre as diversas amostras. É conveniente também, o fornecimento de duas espátulas descartáveis, para facilitar a colocação da amostra fecal no recipiente.

                O uso de substâncias de ação purgativa como o sulfato de sódio deve se restringir aos casos de suspeita de parasitismo por protozoários intestinais principalmente por Entamoeba histolytica. É importante ressaltar que o uso de óleos vegetais pode determinar a formação de glóbulos de gordura e o bismuto e o magnésio podem acarretar formação de cristais e conseqüente alteração da morfologia dos trofozoítas nas dejeções. Pacientes que tenham sido submetidos a utilização de contrastes para estudos radiológicos de sistema digestivo até 7 dias após este procedimento, apresentam fezes impróprias para as técnicas de coprodiagnóstico parasitário

A.2 QUANTIDADE MÍNIMA ACONSELHÁVEL

                Como as técnicas coproparasitologicas se baseiam na análise de possíveis estruturas parasitárias em parte das  fezes eliminadas, por isso denominada  amostra, deve ser respeitada a quantidade mínima de 20 g  que possibilitará a feitura de várias técnicas ou em caso de dúvida a repetição dos exames o que determinará uma maior margem de segurança diagnostica.

A.3 IDENTIFICAÇÃO

                Deve ser feita por preenchimento de etiquetas coladas aos recipientes acondicionantes com lápis ou caneta esferográfica colocando-se o nome, sexo, idade, data, hora da coleta, número do prontuário (caso exista) e como complemento, outros possíveis dados de importância.

A.4 CONSERVAÇÃO

                Quando não for possível a entrega do material no máximo,  algumas horas após sua eliminação, o mesmo pode ser guardado temporariamente em refrigerador até por 12 h ou então, podem ser utilizados  conservantes químicos numa proporção de 2 a 3 partes para cada 1 de fezes. Quando o material fecal    se apresentar aquoso ou amolecido, existe a   possibilidade  de serem encontrados  trofozoitas de  amebídeos que apresentam grande labilidade de conservação, representada pelos seguintes períodos:   2-5 h a  37º C; 6-16 h a 20-25º C e 48-96  h  a 5º C, o que determina quando o material é coletado na residência,  a utilização de fixador/conservador onde destacam-se: Solução de Schaudinn, álcool polivinilico,  SAF e solução de Bouin.

                Outros conservantes, para estruturas parasitárias que não sejam formas trofozoíticas,  são  também utilizados quando  tentando  aumentar  a  chance diagnostica,  especialmente em  fase crônica  das infecções, coletando-se de 2 a 4 amostras de preferencia em frascos individuais contendo conservante e uma última amostra com fezes frescas (sem conservante) eliminada horas antes da chegada ao laboratório, totalizando 3 a 5 amostras. Esta estratégia é importante pois tanto protozoários como helmintos podem não serem eliminados regularmente  nas fezes, ocorrendo assim períodos de baixa ou não eliminação de estruturas parasitárias, fenômeno que pode determinar negatividade nas pesquisas em alguns dos dias de exame, como é o caso das espécies do gênero Taenia que podem ficar até 3 dias sem eliminar proglotes e de E. histolytica onde algumas vezes ocorre pico de eliminação de cistos de 7 em 7 até 10 em 10 dias. A maioria das soluções conservantes tem em sua formula o formol, de forma isolada ou associada a outros produtos químicos. São mais utilizadas  no Brasil o MIF, solução de Railliet & Henry, diversas soluções de formol e SAF.

A.4.1 PRINCIPAIS CONSERVANTES:

a. FORMOL® 5 a 10 %, tendo com diluente,  água destilada deionizada ou solução fisiológica (NaCl a 0.89 % em água destilada deionizada).

b. FORMOL TAMPONADO (NEUTRO) 5 % ® Fosfato monobásico de sódio 0,15 g, fosfato dibásico de sódio 6,1 g, formol 400 ml e água destilada deionizada 7200 ml.

c. MIF (MODIFICADO) ® Solução A: Água destilada deionizada - 250 ml; Mertiolato n.º 99 a 1:1000 ou Mercúrio cromo 2:1000 - 200 ml 40  %, Formol comercial bruto - 25 ml e Glicerina 5 ml.  

Solução B:  Solução parasitológica de Lugol a 5 % (preparada  no máximo a 12 dias e conservada em frasco âmbar).  No dia da entrega dos potes, preparar solução final com 94 % da solução A  e 6 % da solução B.

d. RAILLIET &  HENRY®  Água destilada deionizada 92  %, Formaldeido comercial 5 % e Ácido acético glacial 3 %.

e. FIXADOR DE SCHAUDINN (MODIFICADO) ® Solução saturada de bicloreto de mercúrio (preparar em banho Maria) 20 ml, álcool a 95 % p/v 10ml. Acrescentar 1,5 ml de ácido acético glacial pouco antes de ser  introduzida a amostra fecal.

f. FIXADOR DE SCHAUDINN (MODIFICADO) ® Solução aquosa  de Bicloreto de mercúrio (preparar em banho Maria) : Bicloreto de mercúrio 110 g em  1.000 ml de água destilada deionizada, álcool a 95 % p/v 10ml. Solução Estoque: Solução aquosa de bicloreto de mercúrio 600 ml, álcool etílico a 95 % e 15 ml de glicerina. Fixador: Solução estoque 100 ml  e 5 ml de Ácido acético  glacial.  A solução fixadora deve ser feita  pouco antes de ser  introduzida a amostra fecal.

1. g.    ÁLCOOL POLIVINILICO (APV) - APV 5,0 g, fixador de Schaudinn 93,5 ml, glicerina 1,5 ml, Ácido acético glacial 10 ml, álcool etílico a 95 % 31 ml e água destilada deionizada 62,5 ml. Homogeneizar em Beacker os componentes líquidos. Colocar lentamente o APV em pó,  deixando a mistura em repouso  por 24 h no próprio Beacker. Aquecer a mistura lentamente em banho-maria até chegar em 75⁰  a  80⁰  C, quando for atingida temperatura nesta faixa, retirar do aquecimento e misturar até a completa homogeneização. Estocar em frasco de boca esmerilhada ou de rosca.

1. h.    ÁLCOOL POLIVINILICO (APV)  modificado - Solução A - Dissolver completamente 5 g de APV em 31 ml de álcool etílico a 95 % em balão ou Erlenmeyer com tampa. Adicionar então, 5 ml de ácido acético, homogenizando em agitador magnético. Conservar a solução tampada até o uso.

Solução B - Dissolver 4,5 g de bicloreto de mercúrio em 31 ml de glicerina, em Becker de pequena capacidade, misturando com agitador magnético  até que todas as partículas estejam recobertas por glicerina.  Introduzir a mistura em balão de 150 ml, adicionando em seguida 62,5 ml de água destilada deionizada. Tampar deixando em repouso por 3 a 24 h, se possível agitando-se a mistura de quando em quando. Após repouso, submeter a mistura com a tampa frouxa à banho-maria em temperatura constante na faixa entre 70 a  80⁰ C por 10 min, agitando algumas vezes até completa  homogeneização.

Misturar as duas  soluções no frasco que contém a solução A, agitando a nova mistura. Submeter à banho-maria por 2 a 3 min, até obter solução transparente. Deixar esfriar e estocar em frasco de boca esmerilhada ou de rosca.

Obs. A proporção de fixador é no mínimo 1 da amostra para 3 do fixador. Os fixadores/conservantes  referidos em g e h, também podem ser utilizadas em amostras teciduais obtidas por retossigmoidoscopia

A.5  LAUDO (RESULTADO DA PESQUISA COPROPARASITOLOGICA)

                Deve constar o nome, sexo, idade, aspecto da amostra e método(s) utilizado(s) para a pesquisa coproparasitologica e quaisquer outras informações que sejam de importância. Caso positivo deve constar o nome(s)  do parasito(s) encontrado(s) e respectivas formas parasitárias, sendo que alguns laboratórios ainda informam a concentração relativa através de: cruzes (1 a 4 ou 5) ou dos vocábulos  raras, moderadas ou numerosas. Caso negativo, por se tratar de pesquisa amostral, não se pode afirmar que o hospedeiro não está parasitado, mas sim deve-se registrar que: Não foram evidenciadas formas parasitárias na(s) amostra(s) analisada(s).

A.6  MEDIÇÃO DE ESTRUTURAS PARASITÁRIAS

                Em algumas situações diagnósticas a medição de estruturas parasitárias é elemento importante ou mesmo indispensável para a identificação etiológica do parasita.

FUNDAMENTO: Medição da estrutura parasitária em questão, com escala micrométrica em lente ocular, multiplicada por constante previamente aferida para cada objetiva do microscópio em questão.

INDICAÇÃO: Principalmente para diferenciação ovos de ancilostomídeos e outros estrongilídeos ou trofozoítas de amebídeos onde se destaca o diagnóstico diferencial entre   Entamoeba histolytica e E. hartmanni.

PROCEDIMENTO TÉCNICO:

01. Introduzir na ocular a escala centesimal, retirando-se a parte superior da lente e inserindo no seu interior   o disco de escala ou já ter reservada, a ocular contendo permanentemente tal dispositivo;

02. Coloque a lâmina com escala micrométrica (calibradora) na mesa do microscópio e a focalize em cada uma das objetivas, observando para cada ampliação a relação entre as duas escalas;

03. Registre a proporção em micrômetros (mm) para cada objetiva e guarde tal proporção para futuras medições neste microscópio, retirando a lâmina calibradora em seguida;

04. Coloque a lâmina contendo a amostra clínica, mantendo a ocular micrométrica no microscópio;

05. Proceda a medição pela escala da ocular e multiplique pela constante obtida para aquela objetiva.

Obs. Em posteriores medições neste microscópio, inicie a operação pela etapa 04, utilizando-se  a constante registrada anteriormente para a objetiva em uso.

B. TÉCNICAS  COPROPARASITOLÓGICAS

                A opção por uma ou mais técnicas para pesquisa  de estruturas parasitárias em fezes, é decorrente de vários fatores, tais como as peculiaridades biológicas dos agentes etiológicos suspeitados, pluriparasitismo, disponibilidade de equipamentos e reagentes e até mesmo da experiência ou não do pessoal técnico disponível para execução das mesmas. Por esta razão, é muito importante ter uma rotina, que possa ser alterada em decorrência  dos fatores acima destacados, muitas vezes se utilizando para tal duas ou mais técnicas para aumentar a sensibilidade diagnostica.

B.1 NÍVEIS DE ESTUDO

B.1.1 EXAME MACROSCÓPICO